Sistemas ancestrales CRISPR-Cas para corrección genética de mutaciones en el gen SOD1 asociados a ELA

Sistemas ancestrales CRISPR-Cas para corrección genética de mutaciones en el gen SOD1 asociados a ELA

Investigador Principal: Raúl Pérez-Jiménez

La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es una enfermedad neurodegenerativa sin
cura cuyo origen radica en mutaciones o alteraciones de genes. Concretamente, la
enfermedad ha sido asociada a mutaciones en 20 genes, aunque aún se desconocen
todos los genes implicados en la misma. De todos ellos, uno de los genes más relevantes
en ELA es SOD1. En dicho gen se han detectado más 100 mutaciones relacionadas con
hasta el 20% de los casos hereditarios de ELA (1). Dado que se trata de una enfermedad
cuyo origen reside en mutaciones/alternaciones genéticas, las herramientas de edición
genética desarrolladas en las últimas décadas se han posicionado como una estrategia
clave para tratar dicha enfermedad. Dentro de estas herramientas de edición, destaca
la tecnología CRISPR, concretamente el sistema CRISPR-Cas9 de Streptococcus
pyogenes. En dicho sistema, una endonucleasa, el enzima Cas9 (SpCas9), asociada a un
ARN guía, puede ser dirigida a secuencias específicas de ADN, las cuales pueden ser
cortadas y reemplazadas. A pesar del potencial de esta tecnología, existen numerosas
limitaciones tales como la necesidad de reconocimiento de un motivo adyacente a la
diana (PAM, Protospacer Adjacent Motif) o la propia respuesta inmune contra el enzima,
que limitan la potencial aplicación terapéutica del sistema (2, 3, 4).
Para tratar de superar estas limitaciones, en este proyecto, ejecutado por el
consorcio formado por CIC nanoGUNE, el Hospital Ramón y Cajal y el Hospital 12 de
Octubre Instituto i+12-CIBERER, se está desarrollando la aplicación de ancestros del
sistema CRIPPR-Cas9 obtenidos de especies extintas de firmicutes que existieron hace
2600 millones de años (5). Al tratarse de formas existentes hace 2600 My, la presión
evolutiva sufrida por las mismas ha sido menor siendo enzimas más flexibles y con
menos restricciones. Concretamente, se trata de enzimas que presentan una menor
respuesta inmune en comparación a su forma actual, así como disponen de unos
requerimientos más laxos en relación con la presencia de la secuencia PAM adyacente
a la diana. Este hecho es de especial relevancia, dado que la necesidad de una secuencia
PAM para Cas9 (secuencia NGG, donde N puede ser cualquier nucleótido), supone que
no todas las mutaciones que se producen en genes como SOD1 puedan ser objeto de
corrección. Así, el objetivo principal de este proyecto es el uso de estas formas
ancestrales (anCas) del sistema CRISPR-Cas (Bacilli Common Ancestor -BCA- y Pyogenic
Common Ancestor-PCA-) para la corrección genéticas de mutaciones específicas del gen
SOD1 in vivo utilizando fibroblastos primarios obtenidos de pacientes de ELA.

En el diseño experimental para la ejecución de este proyecto se han seleccionado
un total de 6 líneas celulares de fibroblastos primarios de pacientes de ELA, que
corresponden con un total de 4 mutaciones patogénicas diferentes del gen SOD1,
recogidos en la siguiente tabla:

Utilizando estas secuencias se ha realizado el diseño de un total de 4 RNA guías
(sgRNA), recogidos en la siguiente tabla:

Como se puede observar, este diseño experimental nos ha permitido evaluar la
capacidad de edición tanto de las formas ancestrales en presencia o en ausencia de la
secuencia PAM NGG.
Tras la selección de las mutaciones diana, así como del diseño de los guías, la
primera aproximación del proyecto ha sido la evaluación de la capacidad de corte in vitro
utilizando como sustrato un fragmento de la zona mutada del genoma de los pacientes
portadores de la mutación amplificado mediante PCR (Objetivo 1). Así, durante la
realización de dichos ensayos de actividad (Fig. 1), las formas ancestrales (anCAS BCA y
PCA) así como el enzima SpCas9 se incubaron con los guías diseñados y se evaluó la
capacidad de corte de las mismas mediante visualización en electroforesis en gel.

Figura 1. Esquema gráfico del experimento de evaluación de corte in vitro. Las formas
ancestrales (anCAS BCA y PCA) y el enzima SpCas9 se incuban con los guías (sgRNAs), diseñados para
las distintas mutaciones patogénicas, y con el sustrato a cortar, un fragmento de DNA amplificado
por PCR que corresponde con el gen SOD1 con las distintas mutaciones. Para evaluar la capacidad
de corte de las enzimas se visualiza el corte en electroforesis en gel.
A continuación, tras verificar la capacidad de corte in vitro de los enzimas, el
siguiente paso ha sido la evaluación de la capacidad de corrección mediante edición
genética del gen SOD1 mutado en estas células de pacientes utilizando como
aproximación experimental el proceso celular de recombinación homóloga (Objetivo 2)
(Fig. 2). Para ello, se ha realizado el diseño de 4 fragmentos de ADN de cadena simple
con extremos homólogos complementarios a la zona diana y que presentan la secuencia
corregida del gen. En el desarrollo experimental de este objetivo, se ha realizado la
transfección de las diferentes líneas celulares de fibroblastos pacientes con plásmidos
para la expresión de versiones humanizadas de los enzimas (referencia Addgene:
185702, 185704, 185706- https://www.addgene.org/Raul_Perez-Jimenez/), junto con
los gRNA testados en los experimentos in vitro, así como el fragmento de ADN de cadena
simple. Concretamente, se han evaluado las siguientes condiciones (6 líneas de
pacientes + control de fibroblastos sanos):

o anCas70 + ssDNA + gRNA
o anCas92 + ssDNA + gRNA
o aas9 + ssDNA + gRNA
o anCas70 + ssDNA (CTRL)
o anCas92 + ssDNA (CTRL)
o Cas9 + ssDNA (CTRL)

Figura 2. Esquema gráfico del experimento de corrección del gen SOD1 mutado en células de
pacientes. Fibroblastos primarios de pacientes (foto real en el circulo de la izquierda de la imagen),
fueron transfectados con lipofectamina, introduciendo tanto los plásmidos para la producción de las
enzimas Cas humanizadas (SpCas9, anCas PCA y anCas BCA), los guías (sgRNAs) y el ADN de cadena
simple que actúa como molde para corregir la mutación. Tras la transfección, se producirá el corte
del gen SOD1 patogénico, que se corregirá mediante mecanismos propios de las células de
recombinación homologa, usando como molde el ADN de cadena simple.
Una vez realizada la transfección, el ADN genómico de las células editadas se ha
extraído y amplificado para su posterior análisis. Actualmente, nos encontramos en esta
fase del proyecto, en la que se está analizado la eficiencia de edición obtenida mediante
NGS y el software Mosaic Finder. Además, en esta fase también se analizará y
cuantificará los posibles efectos off-targets producidos durante la edición.

Referencias
1. Yamashita, S. & Ando, Y. Genotype-phenotype relationship in hereditary amyotrophic
lateral sclerosis. Translational neurodegeneration 4, 1-13 (2015).
2. Hu, J.H. et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA
specificity. Nature 556, 57-63 (2018).
3. Walton, R.T., Christie, K.A., Whittaker, M.N. & Kleinstiver, B.P. Unconstrained genome
targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants. Science 368, 290-296
(2020).
4. Crudele, J.M. & Chamberlain, J.S. Cas9 immunity creates challenges for CRISPR gene
editing therapies. Nature Communications 9, 3497 (2018).
5. Alonso-Lerma, B. et al. Evolution of CRISPR-associated Endonucleases as Inferred from
Resurrected Proteins. Preprint. BioRxiv. doi:
https://doi.org/10.1101/2022.03.30.485982